使用具有过水解活性的酶生产过酸
2019-11-22

使用具有过水解活性的酶生产过酸

提供了用于由羧酸酯生产过氧羧酸的方法。更具体地讲,在具有过水解活性的酶催化剂存在下使羧酸酯与无机过氧化氢例如过氧化氢反应。基于保守结构特征,本发明过水解酶催化剂被归类为糖酯酶家族7(CE-7)的成员。此外,还提供了包含通过本发明所述方法产生的过酸的消毒制剂。

实施例33

SEQIDNO:88是编码ThermotogapetrophiIa乙酰木聚糖醋酶编码序列的密码子最优化形式的PCR产物的核酸序列。

SEQIDNO:32是枯草芽孢杆菌ATCC29233™头孢菌素C脱乙酰酶(CAH)的推导氨基酸序列。

从凝胶中切下酯酶阳性条带,并且转移到50ML聚丙烯锥形管(Falcon)内。伴随轻轻混合的2次5mL去离子水洗涤后,从凝胶切片中取出黄色的溴百里酚蓝染色。然后在轻轻混合下将凝胶切片用〇.9mL2XNovexTris-甘氨酸SDS样品缓冲液加100yL10XNuPAGE还原剂(Invitrogen)处理30分钟。样品处理后,使用热水浴将凝胶切片和样品缓冲液于85°C培养5分钟。随后从培养管中取出凝胶切片,并且小心地置于I.5mm8-16%Tris-Gly小凝胶的单个制备孔中。小心地排除气泡并且与成层凝胶直接接触。将在去离子水中制备的250-300yL温0.5%琼脂糖溶液加到制备孔内后,原位固定凝胶切片。将单个分子标记泳道装载15yLSeeBlue®Plus2预染色的MW标记(Invitrogen)〇

由此产生过氧羧酸,从而消毒所述硬质表面或无生命物体。

表11:使用来源于大肠杆菌UM2/pSW186转化体提取物的过水解酶,在pH6.5或7.5下过乙酸(PAA)浓度对甘油三乙酸酯和过氧化氢浓度的依赖性。

在另一个方面,酶促过水解产物可以包含提供所需功能性的另外的成分。这些另外的成分包括但不限于缓冲剂、洗涤剂助剂、增稠剂、乳化剂、表面活性剂、润湿剂、抗腐蚀剂(例如苯并三唑)、酶稳定剂和过氧化物稳定剂(例如金属离子螯合剂)。许多另外的成分是洗涤剂工业中众所周知的(参见例如美国专利5,932,532;在此引入作为参考)。乳化剂的实例包括聚乙烯醇或聚乙烯吡咯烷酮。增稠剂的实例包括但不限于LAPONITE®RD、玉米淀粉、PVP、CARBOWAX®、CARBOPOL®、CABOSIL®、polysorbate20、PVA和卵磷脂。缓冲系统的实例包括但不限于磷酸二氢钠/磷酸氢二钠;氨基磺酸/三乙醇胺;柠檬酸/三乙醇胺;酒石酸/三乙醇胺;琥珀酸/三乙醇胺;和乙酸/三乙醇胺。表面活性剂的实例包括但不限于a)非离子表面活性剂例如环氧乙烷或环氧丙烷的嵌段共聚物,乙氧基化或丙氧基化直链和支链伯醇和仲醇,以及脂族氧化膦,b)阳离子表面活性剂例如季铵化合物,特别是具有与氮原子结合的C8-C20烷基,并且该氮原子还与3个C1-C2烷基结合的季铵化合物,c)阴离子表面活性剂例如链烷羧酸(例如,C8-C20脂肪酸)、烷基膦酸盐、链烷磺酸盐(例如十二烷基硫酸钠"SDS")或直链或支链烷基苯磺酸盐、烯烃磺酸盐和d)两性和两性离子表面活性剂例如氨基羧酸、氨基二羧酸、烷基甜菜碱(alkybetaine)以及它们的混合物。另外的成分可以包括芳香剂、染料和过氧化氢稳定剂(例如金属螯合剂例如1-羟基亚乙基-1,1-二膦酸(DEQUEST®2010,SolutiaInc.,St.Louis,MO和乙二胺四乙酸(EDTA))、1^1^1嫩1^31、0£〇耶31©0520、0£〇耶31«0531、酶活性稳定剂(例如聚乙二醇(?£6))和洗涤剂助剂。

将实施例3中描述的40-60%正丙醇级份的0.1mL样品(500yg总蛋白)在室温下与等体积的2X非变性(天然)样品缓冲液(Invitrogen)混合,并装载到I.5mm8-16%Tris-甘氨酸聚丙稀酰胺小凝胶(2D凝胶;Invitrogen)的制备样品孔内。天然凝胶电泳使用Tris-甘氨酸电泳缓冲液(Invitrogen)在125V下操作90分钟。电泳后,制备凝胶用于使用PH指示剂溴百里酚蓝的原位酯酶活性测定。

克服过酸化学生产的缺点的一种方法是使用酶催化剂代替强酸催化剂。酶催化剂的使用允许在使用和/或应用时快速产生过酸,从而避免了与过酸溶液保存和随着时间的过去过酸浓度变化相关的问题。一般用于经由与过氧化氢的直接化学反应来产生过酸的高浓度的羧酸不是过酸的酶促生产所需的,其中酶催化的反应可以使用浓度比化学反应中一般使用的浓度低得多的羧酸酯作为底物。酶反应可以跨越广泛范围的PH来进行,取决于在给定PH下的酶活性和稳定性,并且取决于在给定pH下对于过水解的底物特异性。

a)Argll8-Glyll9-Glnl20;

来自枯草芽孢杆菌BE1010的讨水解酶的克降和表汰

来自热纤维梭菌(Clostridiathermocellum)ATCC27405™的讨水解酶的克降和表汰